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糖化血红蛋白快速检测几种方法
发布时间:2014-04-19   点击:

  目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白快速检测方法主要有两大类: 一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同, 如离子层析法、电泳等方法; 另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点, 如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。其中高效液相离子层析法(H PLC )被公认为金标法。基于这些方法武汉明德生物科技有限公司开发了糖化血红蛋白(HbA1c)检测试剂盒,让检测变得简单方便易行。

  1. 离子层析法 离子层析法精密度高、重复性好且操作简单, 被临床广泛采用。检测原理由于血红蛋白链N 末端缬氨酸糖化后所带电荷不同, 在偏酸溶液中总糖化血红蛋白( GH b) 及H bA 均具有阳离子的特性, 因此经过阳离子交换层析柱时可被偏酸的缓冲液平衡过的树脂来吸附, 但二者吸附率不同, GH b正电荷较少吸附率较低, H bA 正电荷较多吸附率较高。用不同pH 的磷酸盐缓冲液可以分次洗脱出GH b 和H bA, 用KCN 可将H b转化为高铁氰化血红蛋白, 用分光光度计测定。或者得到相应的H b层析谱, 其横坐标是时间, 纵坐标是百分比。HbA1c值以百分率来表示。现在大部分都用全自动测定仪测定,如日本TOSOH 公司生产的全自动糖化血红蛋白分析仪曾应用于美国糖尿病控制和并发证试验( DCCT) 研究, 其离子交换H PLC法是H bA1c检测的金标准。当前推出的HLC- 723G7从开机到报告第一个结果仅需3. 6 m in, 标本无需前处理, 操作维护都非常方便, 是目前测试GH b精密度、准确性最高的方法。国内主要采用B io- Rex70阳离子树脂微柱层析法, 其微柱可重复使用多次,更大型的仪器有SCIENTIFIC公司的Hb- Gold, 除可全自动测定糖化血红蛋白外, 还可分离检测血红蛋白的600多种变异体和亚型, 用于地中海贫血等疾病的诊断。但其缺点是价格昂贵, 仅在一些发达国家使用, 且容易受到如下干扰: 胎儿血红蛋白(H B -F)与HbA1 c的带电性很相近, 在离子交换HPLC分析图上可能呈现一个独立的H b- F 峰, 也可能与H bA1c 峰重叠( 视离子交换柱的分辨能力而定)。

  2. 手工微柱法 手式微柱操作会受到人工因素影响, 可能会洗脱不完全或过度洗脱并受外界环境温度的影响, 而某些血红蛋白如H bF异常增加时, 也会与糖化血红蛋白同时洗脱, 从而使结果产生偏差。目前有B io- Rad和西班牙B IOSYSTEM S等多家公司产品, 相应的仪器以英国DREW SCIENTIFIC公司DS 5糖化血红蛋白仪为例( B io- Rad公司IASTA 亦为同一产品), 采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术可全自动分离血红蛋白的变异体与亚型, 除可测定糖化血红蛋白外, 还可同时检测出血红蛋白S( H bS)与血红蛋白C( H bC )的存在与否, 在计算糖化血红蛋白值时会自动扣除变异体产生的影响, 从而使结果更为准确, 可靠, 变异系数( CV ) 值< 2%。同时该仪器配有专门的稀释溶血器, 可直接进行全血操作, 5 m in即可报告结果, 并自动储存样品检测结果, 层析柱价格也较为低廉, 适合于较多标本的医院检测,但由于手工操作层析时间和微柱的质量不易控制, 易产生操作技术误差, 重复性欠佳。

  3. 琼脂凝胶电泳法 H b及H bA1带正电荷, 电泳时向负极移动。因为H bA 的β 链N - 末端所带电荷被糖基消除, 带电量少于H bA, 等电点低, 泳动速度慢, 所以H bA1 即GH b本身带红色, 所以可直接比色或扫描。用H bA1 占H b的量来表示。毛细管电泳也能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体。普通电泳法对H bA 和H bA1 分离效果不理想, 目前尚无商品化且具有批量样本通过能力的仪器面世, 相当程度地限制了该方法的临床应用。

  4. 等电点聚集法 也是测定GH b的新技术, 它是在聚丙烯酞凝胶中加人载体两性介质( 如am pho lin) 的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH 梯度, 溶血液中各个组份将移动到各自的等电点的pH 位置上, 这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带, 通过分辨率高的微量光密度仪扫描, 可以准确地测定出各自组份的含量。由于它能够分辨出一级结构不同的H bA、H bA c、H bF、H bS 及H bC等, 可完全避开各种物质的干扰, 是一种理想的方法, 但仪器价格相当昂贵, 难于用作常规检测。

  5. 亲和层析 利用生物高分子能与相应的专一配基分子可逆结合的原理, 将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统, 带有杂质的高分子分离目的物在一定条件下,能以某种次级键与已同相化的配基结合, 而杂质则不吸附, 除去杂质后变换条件, 又可以使待分离的高分子物质重新解离, 获得纯化。GHb的亲和色谱载体是氨基苯硼酸琼脂糖凝胶, 当总的GHb通过载体时, 稳定型GH b分子表面含葡萄糖的顺式二糖醇部分与载体固定相上的硼酸基因呈配位特异结合, 其它非糖化Hb及不稳定型GHb, H bF等, 随流动相(天门冬酞胺缓冲液)流出, 然后用另一种含糖或多经化合物流动相(山梨糖醇缓冲液)将GH b洗脱下来, 利用两部分H b本身的颜色, 在415 nm 条件下测定并计算出亲和色谱所测的GH b。

  英国DREW SC IENT IFIC 公司的DST 糖化血红蛋白分析仪是一种快速床边糖化血红蛋白仪。它采用硼酸亲和层析法, 只需10 ul全血即可在4 m in 内快速分离检测糖化血红蛋白, 为临床提供即时的化验结果, 从而使医生在患者就诊的第一时间明确诊断并制定相应的治疗方案, 特别适合于临床科室使用, 尤其对于小儿患者而言更有优势。其检测结果也完全达到并超过临床要求, CV值在5%以内。

  优点: 操作简单、快速、价廉, 特异性强, 不受异常血红蛋白的干扰, 对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感, 对血标本储存的时间也不象离子交换法那样严格。缺点: 检测结果为糖化血红蛋白总量, 不能测试GH b的单一组份,且包含H bA1的糖化组份, 因此将亲和色谱所测出的GH b 称为总的GHb是不确切的, 严格来说是占不同百分数的各种GH b, 目前对其测定内容的命名国内外尚不统一, 目前日本化学工业株式会社所生产试剂盒称为糖化一亲和色谱GHb, 以便与其他方法所测H bA, 或H bAc相区别。但并不影响它作为可靠的糖代谢指标的价值。大量实验还证明, 该法所测GH b 值与H PLC 等法所测H bA, H bA c及空腹、餐后2 h血糖均呈高度相关, 表明该法对糖尿病患者是一种较理想的病情监测指标。

  6. 离子捕获法 近发展起来的新方法, 代表仪器有Abbo tt的IMX, 其原理是糖化血红蛋白与相应抗体结合后, 联以荧光标记物, 形成一反应复合物, 再联结带负电荷的多聚阴离子复合物, 而在IMX 反应孔中的玻璃纤维预先包被了高分子的四胺合物, 使纤维表面带正电, 使前述的反应复合物吸附在纤维表面, 经过一系列清洗后测定其荧光强度, 从而得到糖化血红蛋白的浓度, 该方法适用于成批糖化血红蛋自标本的检测。

  7. 免疫凝集法 糖化血红蛋白与相应的单抗结合进而发生凝集反应, 通过测定吸光度来表示凝集量, 可用于全自动生化分析仪上进行测定。以免疫分析为基础的仪器( DCA2000) 在最近几年中得到推广, 约在7 m in 内就能读取数据, 要求对样品成批试验, 每次试验均应使用一个新试剂盒, 操作前应注意混匀试剂。免疫比浊法重复性较好, 但易受脂肪血、黄疸等样本因素影响, 抗交叉污染较差, 而且要求血红蛋白在一定范围之间才能达到较好的线性。

  8. 金标免疫渗滤法(金标法) 免疫渗滤法, 操作较简便, 目前代表仪器有挪威NycoCardReaderII特种蛋白多功能全定量金标检测仪。

  9. 化学发光法 采用离子捕捉免疫分析法, 应用抗原抗体反应原理, 联以荧光标记物, 通过连接带负电的多阴离子复合物, 吸附到带正电的纤维表面, 经过一系列彻底清洗等步骤后, 测定荧光强度变化率, 计算浓度。采用专用试剂包和免疫发光分析仪,其检测系统易于规范和重复, 可减少操作技术误差, 检测的灵敏度和特异性高, 批内、批间变异系数小, 回收率高, 准确度高, 交叉污染率小, 影响因素少。

  10. 放射免疫法 优点: 精密度高、特异性强、快速、价格相对便宜, 可批量测试, 且不受各种干扰因素的影响。缺点: 目前对制备高效价的抗体尚存在许多困难, 仍处于研究中, 未能形成商品化试剂盒。

  11. 酶法 原理为用特殊蛋白酶分解Hb, 3~ 5 m in内果糖基氨基酸从H b分离, 果糖基氨基酸氧化酶( FAOD )从果糖基氨基酸产生H2O2, H 2O2经POD与DA- 64反应, 选择751 nm 测吸光度改变求得GH b浓度。